Роль BDNF у маркерах модуляції старіння
Автори: Claudio Molinari, Vera Morsanuto, Sara Ruga, Felice Notte, Mahitab Farghali, Rebecca Galla and Francesca Uberti
Laboratory of Physiology, Department of Translational Medicine, University of Piemonte Orientale, Via Solaroli 17, 28100 Novara, Italy; claudio.molinari@med.uniupo.it (C.M.);
Published: 9 May 2020
Анотація
Нещодавно було продемонстровано важливий зв’язок між старінням мозку та класом факторів росту/виживання, відомих як нейротрофіни. Зокрема, нейротрофічний фактор мозку (BDNF) відіграє ключову роль під час вікової втрати синапсів, запобігаючи атрофії мозку та когнітивному зниженню. Метою цього дослідження було з’ясувати, чи може використання BDNF у низьких дозах із секвенційною кінетичною активацією (SKA) протидіяти деяким механізмам, що лежать в основі дегенерації та старіння нервової тканини, шляхом посилення ендогенних захисних механізмів. Проведено експерименти in vitro та in vivo для оцінки здатності BDNF SKA захищати та відновлювати молекулярні шляхи, пов’язані з виживанням, досліджуючи кишкову абсорбцію in vitro та функцію мозку in vivo. Наші новаторські результати показують, що BDNF SKA здатний стимулювати ендогенне вироблення BDNF, використовуючи його рецептор TrkB і впливаючи на експресію аполіпопротеїну Е. Крім того, BDNF SKA впливав на білки бета-амілоїду та сиртуїну 1, підтверджуючи гіпотезу про тонкий ендогенний регуляторний ефект, який чинить BDNF SKA для підтримки здоров’я нейронів і астроцитів. З цієї причини зміна в обороті BDNF розглядається як позитивний фактор у протидії старінню мозку.
Вступ
Дослідження старіння мозку та нейродегенеративних захворювань є одним із найважливіших викликів, з якими стикається наукова спільнота останніми роками. Механізми, що лежать в основі старіння мозку, численні та тісно пов’язані. Нещодавно було продемонстровано важливу роль класу факторів росту та виживання клітин, відомих як нейротрофіни [1]. Нейротрофіни належать до родини малих білків, які відіграють ключову роль як у центральній, так і в периферичній нервовій системі. Основні функції цих білків включають регуляцію росту аксонів і диференціацію нейронів. До родини нейротрофінів належать фактор росту нервів, нейротрофін-3, нейротрофін-4/5 і, що особливо важливо, нейротрофічний фактор мозку (BDNF) [2]. BDNF є найпоширенішим нейротрофіном у мозку та вважається необхідним для виживання нейронів під час розвитку та формування нейронних мереж у мозку дорослих, здійснюючи свої біологічні дії через рецептори тирозинкінази B (рецептори TrkB) [3]. Він виробляється в мозку різними типами клітин і може транспортуватися за межі мозку через гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ). BDNF відіграє ключову роль під час розвитку мозку, підтримуючи виживання та диференціацію нейронних популяцій периферичної та центральної нервової системи, а також регулюючи синаптогенез, синаптичну передачу та пластичність. Крім того, BDNF відіграє вирішальну роль у механізмах навчання та пам’яті [4]. BDNF та інші нейротрофіни нині вважаються факторами росту з широким спектром функцій поза межами нервової системи, включаючи модуляцію та регуляцію імунної функції [5]. Крім того, BDNF та його специфічні попередники можуть відігравати роль у підтримці виживання попередників тимусних клітин і сприяти процесу їх диференціації [6].
Доклінічне дослідження показало, що порушення сигналізації BDNF причетне до кількох нейродегенеративних розладів, включаючи хворобу Альцгеймера, і призводить до дефіциту вікового навчання [7]. Також було показано, що BDNF здатний взаємодіяти з кисневими радикалами (ROS), дисбаланс яких відіграє роль у механізмах старіння, нейродегенеративних захворюваннях і деяких нейропсихіатричних розладах [7]. Під час старіння мозку спостерігається зниження нормального антиоксидантного потенціалу, що призводить до підвищення вразливості мозку до шкідливих ефектів окисного пошкодження [8]. BDNF вважається одним із захисних агентів проти окисного стресу в центральній нервовій системі [9]. Деякі ділянки мозку, особливо задіяні в нейродегенеративних захворюваннях, такі як гіпокамп, чорна речовина, мигдалина та фронтальна кора, є особливо чутливими до окисного стресу [10]. Роль ROS як маркера старіння мозку підтверджується численними дослідженнями, які демонструють, що зростання цих речовин пов’язане зі зниженням мітохондріальної функції [11,12]. Кілька клінічних досліджень показали зміни концентрації BDNF у крові у пацієнтів із нейропсихіатричними розладами, такими як велика депресія [13], шизофренія [14] та хвороба Альцгеймера [15]. Дослідження, проведені як in vitro, так і in vivo, показали, що експресія BDNF та його специфічного рецептора TrkB є необхідною для підтримки належної кількості проліферуючих стовбурових клітин, для диференціації нейронних популяцій і для дозрівання збуджуючих синапсів [2].
Можливість використання екзогенного BDNF як терапевтичного підходу проти нейродегенеративних захворювань розглядалася останніми роками. Однак введення екзогенного BDNF стикається з кількома проблемами. Основна проблема полягає в кількості BDNF, яка досягає мозку. Якщо ця кількість занадто мала, вона може бути недостатньою для досягнення бажаних ефектів. З іншого боку, якщо вона занадто велика, це може бути парадоксально небезпечним, наприклад, спричинити зниження регуляції рецепторів TrkB, що зменшує внутрішньоклітинний механізм, пов’язаний із BDNF. Можливість проходження BDNF через ГЕБ є досить суперечливою. Деякі автори стверджують, що неясно, чи може BDNF легко перетинати ГЕБ [16], тоді як інші вказують, що BDNF здатний це зробити [17]. Для подолання таких проблем доставки було розроблено різні методи, які, однак, не повністю вирішили проблему [18]. Інші дослідження повідомили про додаткові проблеми, пов’язані з введенням нейротрофінів людям, залежно від дози та фармакокінетики цих молекул [19]. Перспективним способом досягнення тонкої регуляції фізіологічних механізмів може бути використання речовин у низьких дозах, як показали численні дослідження, доступні в літературі [20,21]. Кілька експериментальних досліджень також показали, що введення біоактивних молекул у низьких дозах є ефективним для отримання чистих біологічних ефектів із низькою ймовірністю побічних ефектів.
Наразі не існує терапій, здатних зупинити процес загибелі нейронів, який запускає нейродегенеративні захворювання. Використання родини нейротрофічних факторів, до якої належить BDNF, дефіцит яких виявлено при старінні мозку та в різних патологічних станах, може стати ефективним терапевтичним рішенням. Однак залишається багато проблем, які потрібно вирішити, таких як розрахунок дози, протокол введення та проходження через ГЕБ. Таким чином, метою цього дослідження було проаналізувати ефект низьких доз BDNF на продукцію ROS як у культивованих астроцитах, так і в кортикальних нейронах, спостерігаючи за поведінкою ендогенних антиоксидантних механізмів. Крім того, були проведені експерименти для покращення переносимості речовини шляхом вивчення її здатності чинити сприятливі ефекти на молекулярні шляхи, пов’язані з життєздатністю нервової тканини. Нарешті, експерименти проводилися як in vitro, так і in vivo, щоб оцінити характеристики кишкової абсорбції після перорального введення BDNF та оцінити здатність BDNF перетинати ГЕБ.
Матеріали та методи
2.1. Приготування розчинів BDNF
Усі розведення готувалися з вихідного розчину (0,001 нг/мл) BDNF 4CH у 0,9% NaCl. На основі попередніх знань про активовані суміші розчини BDNF готувалися у двох різних концентраціях: 1 пг/мл для досліджень in vitro та 1,20 пг/мл для досліджень in vivo. Кожна концентрація готувалася за методом секвенційної кінетичної активації (SKA) [21]. Ці розчини активувалися кінетично за допомогою механічно прикладеної сили через стандартизований процес струшування (секвенційна кінетична активація, названа SKA), що характеризується вертикальним струшуванням, яке відповідає 100 коливанням за 10 секунд. Усі розчини готувалися в лабораторіях GUNA (GUNA S.p.a, Мілан, Італія). Для кожного оброблення об’єм кожного розчину розраховувався шляхом порівняння з об’ємом, доданим до зразка, обробленого 50 нг/мл BDNF для досліджень in vitro [23] та 25 нг/мл BDNF для експериментів in vivo [24]. BDNF, використаний для порівняння результатів із BDNF 1 пг/мл SKA, не піддавався обробці SKA, щоб відтворити ті самі експериментальні умови, що й в інших дослідженнях.
2.2. Ізоляція астроцитів
Первинні культури астроцитів мишей отримували з новонароджених мишей C57BL/6 за класичною технікою [25] відповідно до національних рекомендацій щодо використання та догляду за лабораторними тваринами. Коротко, протягом 24 годин після народження мишенят евтаназували, кору головного мозку вирізали, подрібнювали, механічно розщеплювали та залишали осідати протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Клітинну суспензію центрифугували при 800 об/хв протягом 5 хвилин, а осаджені клітини ресуспендували в нейрональному базовому середовищі (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), доповненому 5% фетальною телячою сироваткою (FBS, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 1% пеніциліном/стрептоміцином (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та 2 мМ L-глутаміном (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія). Клітини висівали в мультилуночні планшети та підтримували в культурі протягом 6 днів до оброблення. Клітини висівали з щільністю 4×10⁴ астроцитів/см² на 24-луночну підтримку Transwell для підготовки моделі ГЕБ; 1×10⁴ на 96-луночні планшети для фарбування MTT та кристалічним фіолетовим; 4×10⁴ клітин на чорні 96-луночні планшети для вивчення споживання кисню та мітохондріального мембранного потенціалу; 5×10⁴ клітин на 24-луночні планшети для аналізу виробництва реактивних форм кисню (ROS); 2×10⁵ клітин на 24-луночні планшети для кількісного визначення BDNF; та 1×10⁶ клітин на 6-луночні планшети для аналізу внутрішньоклітинних шляхів за допомогою вестерн-блоту та активності ERK за тестом ELISA.
2.3. Первинні кортикальні нейронні клітини
Первинні культури кортикальних нейронів мишей отримували з мозку новонароджених мишей C57BL/6 (P0), як зазначено в літературі [26]. Усі процедури, використані в цих дослідженнях, відповідають рекомендаціям Національного інституту здоров’я. Кору вирізали з ембріональних мозків, тканину механічно дисоціювали та залишали осідати протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Після центрифугування надосад ресуспендували в нейрональному базовому середовищі (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), доповненому 2% B27 (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 1% пеніциліном/стрептоміцином (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та 2 мМ L-глутаміном (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія). Клітини висівали на попередньо покриті планшети з 10 мкг/мл полі-L-лізину з щільністю 1×10⁶ клітин/мл і підтримували в інкубаторі при 37°C з 5% CO₂ та 95% вологістю. На третій день після висівання середовище змінювали. Усі експерименти проводилися на первинних кортикальних нейронних клітинах, культивованих протягом 9–10 днів in vitro. Клітини висівали з щільністю 1×10⁴ на 96-луночні планшети для MTT; 5×10⁴ клітин на 24-луночні планшети для аналізу виробництва реактивних форм кисню (ROS); 2×10⁵ клітин на 24-луночні планшети для кількісного визначення BDNF; та 4×10⁴ клітин на чорні 96-луночні планшети для вивчення споживання кисню та мітохондріального мембранного потенціалу.
2.4. Протокол експерименту in vitro
Перед обробленням як первинні кортикальні нейронні клітини, так і астроцити підтримували в модифікованому середовищі Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) без червоного фенолу та FBS, доповненому 1% пеніциліном/стрептоміцином (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 2 мМ L-глутаміном (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та 1 мМ піруватом натрію (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) при 37°C, 5% CO₂ та 95% вологості протягом 1 години. Клітини обробляли 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF на момент T0, перевіряли кожні 24 години та підтримували протягом 6 днів (так званий 6-денний протокол). Також аналізували носій — фізіологічний розчин. Крім того, досліджували залучення TrkB за допомогою специфічного антагоніста ANA-12 (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) [27], обробляючи клітини за 30 хвилин до стимуляції. Додаткові експерименти проводилися для аналізу здатності розчинів BDNF відновлювати пошкодження, спричинені окисним стресом, який є основною причиною старіння та нейродегенерації. Як кортикальні нейронні клітини, так і астроцити попередньо обробляли 200 мкМ H₂O₂ (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) [28] протягом 30 хвилин, після чого обробляли 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF. Нарешті, астроцити використовували в дослідженні з часовим контролем протягом 24 годин для імітації дозування, застосовуваного у людей.
2.5. Модель кишкового бар’єру in vitro
Клітини Caco-2 (людські епітеліальні клітини колоректальної аденокарциноми), придбані в American Type Culture Collection (ATCC, Манассас, Вірджинія, США), використовувалися як експериментальна модель [29] для прогнозування характеристик кишкової абсорбції після перорального введення [30]. Ці клітини вирощувалися в повному середовищі, що складалося з модифікованого середовища Дульбекко/поживної суміші F-12 Ham (DMEM-F12, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), доповненого 10% фетальною телячою сироваткою (FBS, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 2 мМ L-глутаміном (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 1% пеніциліном-стрептоміцином (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та підтримувалися в інкубаторі при 37°C з 5% CO₂ та 95% вологістю. Клітини використовувалися з 46 до 49 пасажів і висівалися в 24-луночні поліестерові трансвел-планшети Corning® Costar® (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) в повному середовищі. Клітини культивувалися до 21 дня в зволоженому інкубаторі при 37°C в атмосфері 5% CO₂, змінюючи середовище кожні 3 дні спочатку базолатерально, а потім апікально. Цілісність моношару перевірялася кожні 3 дні (під час зміни середовища) [31]. Після 21 дня 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF додавалися до культури середовища за різних умов pH, як зазначено в літературі [31]; препарати з pH 6,5 додавалися на апікальну сторону, тоді як pH 7,4 — на базолатеральну. Злегка кислий pH (pH 6,5) на апікальній стороні відповідає середньому pH у просвіті тонкого кишечника, тоді як нейтральний pH (pH 7,4) на базолатеральній стороні імітує pH крові. Під час оброблення клітини підтримувалися в інкубаторі з 5% CO₂, і наприкінці стимуляцій кількість BDNF вимірювалася за допомогою набору ELISA після 30 хв і 1, 3, 4, 5 та 6 год від стимуляції. Ця модель підходить для прогнозування абсорбції речовин після перорального введення шляхом оцінки видимого коефіцієнта проникності (Papp) [31,32]. Коротко, Papp (см/с) розраховувався як [29]:
Papp = dQ/dt × 1/m₀ × 1/A × V_Donor
dQ: кількість транспортованої речовини (нмоль або мкг)
dt: час інкубації (с)
m₀: кількість субстрату, введеного в донорський компартмент (нмоль або мкг)
A: площа поверхні трансвел-мембрани (см²)
V_Donor: об’єм донорського компартменту (см³)
Негативні контролі без клітин тестувалися для виключення впливу трансвел-мембран.
2.6. Експериментальна модель гематоенцефалічного бар’єру (ГЕБ)
Астроцити спільно культивувалися з клітинами ендотелію пупкової вени людини (HUVEC) відповідно до методів, описаних у літературі [33]. HUVEC були придбані в ATCC®. Клітини культивувалися в середовищі EGM (Lonza, Базель, Швейцарія), доповненому 10% FBS (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 1% пеніциліном/стрептоміцином (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та 2 мМ глутаміном (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) при 37°C у зволоженій атмосфері з 95% повітрям та 5% CO₂. Коротко, для створення бар’єру ГЕБ 4×10⁴ астроцитів/см² висівалися на базолатеральну сторону перевернутих 6,5-мм трансвелів з поліестеровою мембраною з порами 0,4 мкм (Corning Costar, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) і залишалися для прикріплення протягом 4 годин. Трансвели потім поверталися в нормальну орієнтацію, і клітини залишалися рости протягом 48 годин. Після цього часу 1×10⁵ клітин HUVEC/см² висівалися в апікальний компартмент. Вставки потім розміщувалися в 24-луночний планшет. Після 7 днів культури трансвели оброблялися, і проводилися дослідження проникності [34]. Для розуміння здатності тестованої речовини перетинати гематоенцефалічний бар’єр середовище на нижній стороні трансвелів кількісно оцінювалося з часом шляхом вимірювання об’єму та концентрації BDNF.
2.7. Кількісне визначення нейротрофічного фактора мозку (BDNF)
Кількісне визначення нейротрофічного фактора мозку (BDNF) вимірювалося за допомогою набору Rat BDNF Elisa Kit (Thermo ScientificTM, Волтем, Массачусетс, США) в клітинних супернатантах, отриманих з базолатерального середовища ГЕБ, первинних кортикальних нейронних клітин, астроцитів, сироватки та тканини мозку для кількісного визначення BDNF відповідно до інструкцій виробника. Тканини промивалися в фізіологічному розчині, зважувалися, розрізалися на дрібні шматочки та гомогенізувалися (100 мг тканини/300 мкл) з холодним лізисним буфером (0,1 М Tris, 0,01 М NaCl, 0,025 М EDTA, 1% NP40, 1% Triton X-100; Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), доповненим 2 мМ ортованадатом натрію, 0,1 М фторидом натрію (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 1:100 сумішшю інгібіторів протеаз (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та 1:1000 фенілметилсульфонілфторидом (PMSF; Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), використовуючи електричний гомогенізатор при 1600 об/хв протягом 2 хвилин. Екстракти тканини центрифугувалися при 13000 об/хв протягом 20 хвилин при 4°C.
Клітинні та тканинні супернатанти збиралися, і кожен зразок тестувався за допомогою набору ELISA. Коротко, біотинілізоване антитіло детекції додавалося в кожну лунку, і планшет інкубувався протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім, після 45 хвилин інкубації з HRP-кон’югованим стрептавідином, додавали розчин субстрату TMB протягом 30 хвилин, і реакцію зупиняли додаванням розчину Stop. Концентрацію BDNF визначали шляхом вимірювання абсорбції за допомогою спектрометра (VICTOR X4, багатопозначковий планшетний рідер) при 450 нм і розраховували шляхом порівняння результатів зі стандартною кривою BDNF.
2.8. Аналіз MTT
Аналіз MTT на основі набору In Vitro Toxicology Assay Kit (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) проводився на обох типах клітин для визначення життєздатності клітин, як описано раніше [35]. Коротко, наприкінці кожної стимуляції клітини інкубувалися з 1% барвником MTT протягом 2–3 годин при 37°C в інкубаторі, доки фіолетові кристали не розчинялися в рівному об’ємі розчину для солюбілізації MTT. Відносну життєздатність (%) визначали на основі абсорбції, виміряної за допомогою спектрометра (VICTOR X4, багатопозначковий планшетний рідер) при 570 нм з корекцією при 690 нм. Нарешті, життєздатність розраховували шляхом порівняння результатів з контрольними клітинами (визначеними як 100% життєздатні).
2.9. Фарбування кристалічним фіолетовим
Після кожної обробки астроцити фіксувалися 1% глутаровим альдегідом (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, промивалися та фарбувалися 100 мкл 0,1% водного розчину кристалічного фіолетового (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. До мультилуночних планшетів додавали 100 мкл 10% оцтової кислоти та перемішували перед вимірюванням абсорбції при 595 нм за допомогою спектрометра (VICTOR X4, багатопозначковий планшетний рідер). Орієнтовну кількість розраховували шляхом порівняння результатів з контрольними клітинами, підрахованими на T0.
2.10. Продукція ROS
Швидкість реактивних форм кисню (ROS) вимірювалася за стандартним протоколом на основі додавання цитохрому C (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) до зразків та іншого зразка з 100 мкл супероксиддисмутази (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія). Їх додавали протягом 30 хвилин в інкубатор при 37°C, 5% CO₂ та 95% вологості для визначення антиоксидантної здатності розчинів BDNF на моделі ГЕБ, первинних кортикальних нейронних клітинах та астроцитах. Наприкінці стимуляцій 100 мкл супернатанту вимірювали при 550 нм за допомогою спектрометра (VICTOR X4, багатопозначковий планшетний рідер), і O₂ виражали як середнє ± SD (%) наномолів на відновлений цитохром C на мікрограм білка порівняно з контролем [36].
2.11. Продукція NO
Продукцію оксиду азоту (NO) вимірювали за допомогою аналізу Грісса (Promega Corporation, Медісон, Вісконсін, США). Після 6 днів оброблення супернатанти базолатерального ГЕБ змішували з рівними об’ємами реагенту Грісса та інкубували в темряві при кімнатній температурі протягом 10 хвилин; абсорбцію вимірювали за допомогою спектрометра при 570 нм. Продукція NO відповідала кількості NO (мкмоль), виробленій після кожної стимуляції зразками, кожен з яких містив 1,5 мкг білка [37].
2.12. Мітохондріальний мембранний потенціал
Мітохондріальний мембранний потенціал аналізували відповідно до інструкцій виробника набору Oxygen Consumption/Mito membrane Potential Dual Assay Kit (Cayman Chemical Company, Енн-Арбор, Мічиган, США) [38]. Мітохондріальний мембранний потенціал вимірювали за допомогою агрегатів JC-1 при збудженні/емісії 560/590 нм та мономерів при збудженні/емісії 485/535 нм у флуоресцентному спектрометрі (VICTOR X4, багатопозначковий планшетний рідер). Результати виражали як середнє ± SD (%) порівняно з контрольними клітинами в обох типах клітин.
2.13. Аналіз активації ERK
Активність ERK/MAPK вимірювали за допомогою InstantOne ELISA (Thermo Fisher, Мілан, Італія) на лізатах астроцитів відповідно до інструкцій виробника [36]. Коротко, 50 мкл/лунку лізатів астроцитів, лізованих буфером для лізису клітин, тестували в смужках мікропланшету InstantOne ELISA після 1 години при кімнатній температурі на мікропланшетному шейкері з коктейлем антитіл. Наприкінці додавали реагент детекції протягом 20 хвилин, а потім реакцію зупиняли додаванням розчину Stop. Смужки вимірювали за допомогою спектрометра (VICTOR X4, багатопозначковий планшетний рідер) при 450 нм. Результати виражали як середню абсорбцію (%) порівняно з контролем.
2.14. Вестерн-блот
Для проведення аналізу вестерн-блоту 1×10⁶ астроцитів, висіяних у 6-луночні планшети, лізували на льоду в буфері Ripa (50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолевої кислоти, 10% гліцерину, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA, 1 мМ NaF; Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), доповненому 2 мМ ортованадатом натрію та 1:100 сумішшю коктейлю інгібіторів протеаз (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія). 30 мкг білків розділяли на 8% та 15% гелях SDS-PAGE. Тканину мозку також аналізували за допомогою вестерн-блоту для перевірки механізмів, спостережуваних у клітинній культурі. Наприкінці оброблення тканину мозку вирізали, промивали в крижаному фізіологічному розчині, зважували, розрізали на дрібні шматочки та гомогенізували (100 мг тканини/300 мкл) з холодним лізисним буфером (0,1 М Tris, 0,01 М NaCl, 0,025 М EDTA, 1% NP40, 1% Triton X-100; Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), доповненому 2 мМ ортованадатом натрію, 0,1 М фторидом натрію (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), 1:100 сумішшю інгібіторів протеаз (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та 1:1000 фенілметилсульфонілфторидом (PMSF; Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), використовуючи електричний гомогенізатор при 1600 об/хв протягом 2 хвилин. Екстракти тканини центрифугувалися при 13000 об/хв протягом 20 хвилин при 4°C, і 40 мкг кожного лізату розділяли на 8% та 15% гелях SDS-PAGE. Полівінілідендифторидні (PVDF) мембрани (GE Healthcare Europe GmbH, Мілан, Італія), отримані з клітинних і тканинних лізатів мозку, інкубувалися протягом ночі при 4°C зі специфічними первинними антитілами: анти-фосфо-тирозин рецептор кінази B (p-TrkB, Tyr515; 1:250, Santa Cruz, Каліфорнія, США), анти-тирозин рецептор кінази B (trkB; 1:250, Santa Cruz, Каліфорнія, США), анти-аполіпопротеїн E (apoE, E4; 1:250, Santa Cruz, Каліфорнія, США), анти-фосфо-сиртуїн1 (pSIRT1, Ser47; 1:1000, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), анти-фосфо-p44/p42 мітоген-активована протеїнкіназа (pERK/MAPK, Thr202/Tyr204; 1:1000, Euroclone, Мілан, Італія), анти-p44/p42 мітоген-активована протеїнкіназа (ERK/MAPK; 1:1000, Euroclone, Мілан, Італія) та анти-фосфо-тау (pTau, Ser262; 1:250, Thermo Fisher Scientific, Волтем, Массачусетс, США). Крім того, в мозку також досліджували анти-BDNF (1:500, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) та анти-β-амілоїд (APP, B-4, 1:500, Santa Cruz, Каліфорнія, США). Усі експресії білків нормалізували до специфічного загального білка (якщо можливо), перевіреного через детекцію β-актину (1:5000, Sigma-Aldrich, Мілан, Італія), і виражали як середнє ± SD (%).
2.15. Модель на тваринах
12-місячні миші дикого типу C57BL/6jOlaHsd, порівнянні за віком з літньою людиною (близько 80 років) [39], придбані в Envigo (Брессо, Італія), використовувалися для підтвердження ефектів розчинів BDNF у складній моделі (n = 52). Починаючи з нового протоколу для моделювання перорального введення [40] ми розробили нову риссоль без бромофенолового синього, що містила 1,2 пг/мл BDNF SKA або 25 нг/мл BDNF, яку добровільно споживали старі миші. Кількість риссолей розраховувалася з урахуванням кількості їжі та щоденної води, яку зазвичай споживають тварини [41]. Етапи приготування риссолей описані в Додатку А. Тварини мали вільний доступ до їжі та води ad libitum, а експериментальних особин переводили в окремі клітки та утримували в окремій ізольованій кімнаті при постійній температурі 21–22°C і вологості 5–55% протягом 3 годин [40,42]. Через короткий час введення риссолі миші не виявляли ознак соціальної депривації, таких як підвищена агресивність. Такі ознаки спостерігалися при соціальній депривації протягом 6 годин [43]. Після цього часу риссоль розміщували в нижній частині клітки, але миша мала вільний доступ до їжі та води у верхній частині. Час стимуляції починався з моменту додавання риссолі. Протягом усього періоду оброблення стан здоров’я мишей контролювався. Сироватку отримували з крові, зібраної шляхом інтракардіального забору після введення анестезії, а тканину мозку отримували після загибелі тварини. Усі експериментальні процедури на тваринах були розглянуті та схвалені університетським комітетом OPBA (Орган, відповідальний за добробут тварин) відповідно до місцевих етичних стандартів і протоколів, затверджених національними рекомендаціями (Схвалення № 41/2019-PR). Тварини були рандомізовані на чотири різні періоди оброблення: необроблені (12 тварин, по 4 на кожен період оброблення), 24 години (20 тварин), 24 години плюс 24 години (10 тварин) і 6-денний протокол (лише одна адміністрація протягом 6 днів, 10 тварин). Зокрема, 24 тварини були забиті через 24 години, а 14 тварин — через 48 годин (24 години з риссоллю плюс 24 години без введення риссолі, але тварини мали доступ до їжі та води ad libitum у верхній частині клітки). Нарешті, для демонстрації ефективності оброблення 14 тварин були забиті через 6 днів після єдиного введення розчину BDNF (6-денний протокол). Усі групи забивали в певні часові точки (24 години, 24 години плюс 24 години та 6 днів) шляхом асфіксії CO₂, а кров забирали одночасно. Кров центрифугували при 3500 об/хв протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, а сироватку зберігали при -80°C для подальших експериментів. Крім того, мозок вилучали, заморожували та зберігали при -80°C для подальшого аналізу за допомогою ELISA та вестерн-блоту на лізатах тканини цілого мозку.
2.16. Статистичний аналіз
Кожна частина дослідження підкріплена щонайменше 4 незалежними експериментами як in vitro, так і in vivo. Усі результати аналізувалися за допомогою одностороннього аналізу дисперсії (ANOVA) з подальшим пост-тестом Бонферроні; дані виражені як середнє ± SD щонайменше чотирьох незалежних експериментів для кожного експериментального протоколу, виконаного в трьох повтореннях. Відсоткові значення порівнювалися за допомогою тесту Манна-Уїтні U. Порівняння між двома групами проводилися за допомогою двостороннього t-тесту Стьюдента. Множинні порівняння між групами аналізувалися за допомогою двостороннього ANOVA з подальшим двостороннім пост-тестом Даннета. Значення p < 0,05 вважалося статистично значущим.
Результати
Ефективність BDNF SKA досліджувалася за допомогою експериментів in vitro та in vivo, порівнюючи 1 пг/мл та 1,2 пг/мл із BDNF 50 нг/мл та 25 нг/мл відповідно.
3.1. Потенційна кишкова абсорбція, оцінена in vitro
Оскільки BDNF SKA може застосовуватися перорально для людини, була досліджена кишкова абсорбція in vitro. Модель кишкового бар’єру in vitro була створена для вивчення здатності 1 пг/мл BDNF SKA порівняно з 50 нг/мл BDNF перетинати кишковий бар’єр і ставати доступним для організму. Аналіз об’єму в базолатеральному компартменті показав, що 1 пг/мл BDNF SKA демонструє значне збільшення абсорбційної здатності порівняно з фізіологічним розчином і порівнянне з 50 нг/мл BDNF на кожному етапі стимуляції (Таблиця 1). Зокрема, максимальне значення Papp, константи проникності, спостерігалося через 1 годину оброблення 1 пг/мл BDNF SKA (приблизно 4,18 ± 0,1), що підтверджує гіпотезу, що BDNF SKA здатний перетинати кишковий бар’єр.
За стандартною конверсією для прогнозування абсорбції в людини після перорального введення на основі значень Papp, отриманих із клітин Caco-2, біодоступність BDNF у людини (Таблиця 1) показала зростання, спричинене 1 пг/мл BDNF SKA порівняно з фізіологічним розчином та 50 нг/мл BDNF на кожному етапі оброблення, і підтвердила вищий рівень через 1 годину стимуляції (приблизно 4% порівняно з 50 нг/мл BDNF). Ці дані підтверджують, що 1 пг/мл BDNF SKA здатний перетинати кишковий бар’єр і має хорошу біодоступність порівняно з 50 нг/мл BDNF.
Оскільки безпека є основною проблемою, що впливає на використання в людини, проводилися додаткові експерименти з оцінки виробництва ROS на кишковому бар’єрі для виключення будь-яких побічних ефектів. Як 50 нг/мл BDNF, так і 1 пг/мл BDNF змогли підтримувати ROS на фізіологічному рівні (p > 0,05 порівняно з фізіологічним розчином та контролем), що підтверджує безпечне використання цієї речовини (Додаток B: Малюнок A2). Крім того, вищий ефект 1 пг/мл BDNF порівняно з 50 нг/мл спостерігався через 3 та 4 години оброблення (p < 0,05 порівняно з фізіологічним розчином, 50 нг/мл BDNF та контролем), демонструючи кращу антиоксидантну дію BDNF SKA. Ці дані підтверджують гіпотезу, що BDNF SKA здатний перетинати кишковий бар’єр і досягати крові протягом перших 3–4 годин після перорального введення.
Оскільки найважливішим параметром після перорального введення є здатність BDNF досягати тканини мозку, було проведено додаткові експерименти з використанням моделі ГЕБ in vitro. Аналіз об’єму базолатерального компартменту для 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF не показав значних відмінностей між 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF (Рисунок 1A), але кількісна оцінка показала значне зростання (p < 0,05) як для 1 пг/мл BDNF SKA, так і для 50 нг/мл BDNF порівняно з контролем та фізіологічним розчином (приблизно 41% і приблизно 44% відповідно). Ці дані свідчать, що лише одна обробка протягом шести днів є більш значущою для досягнення більшого ефекту.
Крім того, було проаналізовано продукцію ROS для виключення будь-яких побічних ефектів, спричинених розчинами BDNF. Як показано на Рисунку 1B, не було виявлено явних відмінностей між 1 пг/мл BDNF SKA та 50 пг/мл BDNF, і ефекти обох розчинів не були значними (p > 0,05) порівняно з контролем, що вказує на фізіологічну продукцію ROS. Ці дані підтвердили гіпотезу про вищу ефективність протоколу введення.
Оскільки підтримання балансу окисних умов є важливим параметром для збереження цілісності клітин мозку, були проведені додаткові експерименти для аналізу виробництва NO в межах ГЕБ (Рисунок 1C). На базолатеральному рівні продукція NO, викликана протоколом A, була значно знижена порівняно з контролем (p < 0,05). Зокрема, не було значних відмінностей між обробленням 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF, що свідчить про те, що розчини BDNF не були цитотоксичними.
Малюнок 1. Аналіз ефектів на рівні гематоенцефалічного бар’єру (ГЕБ)
(a) Кількісне визначення нейротрофічного фактора мозку (BDNF), (b) продукція реактивних форм кисню (ROS) та (c) вимірювання NO.
Дані виражені як середнє ± SD (%) від чотирьох незалежних експериментів, виконаних у трьох повтореннях, нормалізованих до контролю (0 лінія як контроль). * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з фізіологічним розчином.
3.3. Дія BDNF SKA на моношарову культуру
Ці результати свідчать, що 1 пг/мл BDNF SKA мав подібний ефект до 50 нг/мл BDNF, незважаючи на різні концентрації, і що лише одна обробка здатна викликати сприятливий ефект. Нарешті, підтверджено, що BDNF SKA діє без будь-яких побічних ефектів на нейронному рівні.
Додаткові експерименти були проведені для вивчення життєздатності клітин та продукції ROS у моношарових культурах клітин, оскільки було продемонстровано, що BDNF здатний діяти як на кортикальні нейронні клітини, так і на астроцити. Зокрема, 1 пг/мл BDNF SKA викликав значно більшу життєздатність клітин (Малюнок 2A) як у первинних кортикальних нейронних клітинах, так і в астроцитах порівняно з контролем (p < 0,05) та 50 нг/мл BDNF (у нейронних клітинах приблизно 124% та 75% відповідно, в астроцитах приблизно 58,6% та 171% відповідно). Ці результати вказують на те, що хоча BDNF SKA використовувався в нижчих концентраціях, він зміг забезпечити більший ефект на життєздатність клітин порівняно з вищою концентрацією; крім того, ці дані підтверджують гіпотезу про ефективність одноразового введення порівняно з багаторазовими введеннями.
Малюнок 2. Ефекти розчинів BDNF на первинні кортикальні нейронні клітини та астроцити
(a) Життєздатність клітин і (b) продукція реактивних форм кисню (ROS), виміряні для обох типів клітин. (c) Показані ефекти на проліферацію астроцитів.
Дані виражені як середнє ± SD (%) від чотирьох незалежних експериментів, виконаних у трьох повтореннях, нормалізованих до контролю (0 лінія як контроль). * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з фізіологічним розчином; p < 0,05 порівняно з однаковими обробками між первинними кортикальними нейронними клітинами та астроцитами в тому ж протоколі.
Оскільки надмірна продукція реактивних форм кисню (ROS) є важливим фактором, що сприяє старінню мозку, були проведені додаткові експерименти з оцінки виробництва ROS в обох типах клітин за двома протоколами оброблення (Рисунок 2B). Результати цих експериментів показують, що 1 пг/мл BDNF SKA здатний підтримувати продукцію ROS у фізіологічному діапазоні як у кортикальних нейронних клітинах, так і в астроцитах (p > 0,05 порівняно з контролем). Ці дані свідчать, що BDNF SKA здатний підтримувати редокс-баланс навіть у моношарових культивованих клітинах. Хоча 50 нг/мл BDNF також демонструє подібні властивості, ефект був значно нижчим порівняно з 1 пг/мл BDNF SKA.
На основі попередніх спостережень щодо життєздатності та виробництва ROS в астроцитах також досліджувалася роль розчинів BDNF у проліферації клітин за допомогою фарбування кристалічним фіолетовим. Як показано на Рисунку 2C, оброблення 1 пг/мл BDNF SKA змогло збільшити проліферацію астроцитів (p < 0,05) порівняно з контролем (приблизно 43,9% та 13,4% відповідно) та фізіологічним розчином (приблизно 43,5% та 29,6% відповідно). Крім того, була підтверджена важливість використаної концентрації. Справді, 1 пг/мл BDNF SKA виявився ефективнішим, ніж 50 нг/мл BDNF (приблизно 3,1%).
3.4. Внутрішньоклітинні шляхи, активовані BDNF SKA в моношаровій культурі
Оскільки всі наведені вище результати показують кращий вплив на астроцити порівняно з тим же протоколом на нейронах, внутрішньоклітинні шляхи досліджувалися лише на астроцитах. На цьому етапі дослідження вивчалися внутрішньоклітинні шляхи, залучені до раніше спостережуваних ефектів. Досліджувалися ефекти, викликані 1 пг/мл BDNF SKA, на експресію ApoE, фосфорилювання SIRT1, шлях ERK/MAPK та рівні активації рецептора BDNF, TrkB.
Як показано на Рисунку 3A, розчини BDNF, здається, діють через рецептор TrkB. Не було виявлено значних відмінностей між 50 нг/мл BDNF та 1 пг/мл BDNF SKA, що вказує на здатність 1 пг/мл BDNF SKA активувати рецептор TrkB для здійснення своїх ефектів, незважаючи на низьку дозу. Щодо експресії ApoE, вона значно зросла при обробленні 1 пг/мл BDNF SKA (p < 0,05) порівняно з 50 нг/мл BDNF (приблизно 80%) (Рисунок 3B). Як показано на Рисунку 3C, фосфорилювання SIRT1, викликане 1 пг/мл BDNF SKA (p < 0,05), було підвищеним порівняно з 50 нг/мл BDNF (приблизно 30%), що підтверджує ефективність дозування для збільшення присутності цієї молекули.
Нарешті, як показано на Рисунку 3D, BDNF підвищував експресію ERK1/2, причому більший ефект був отриманий при 1 пг/мл BDNF SKA (p < 0,05) порівняно з 50 нг/мл BDNF (приблизно 37%).
Додаткові експерименти були проведені для підтвердження участі рецептора TrkB у раніше спостережуваних ефектах за допомогою попереднього оброблення селективним антагоністом TrkB ANA-12 (1 мкг/мл) на астроцитах. Як показано на Рисунку 4, у присутності обох розчинів BDNF експресія TrkB була скасована попередньою обробкою 1 мкг/мл ANA-12, що підтверджує, що обидва розчини BDNF діють через рецептор TrkB для пояснення їх ефектів на астроцити. Ці дані підтверджують важливість дозування та протоколу оброблення для отримання сприятливого ефекту на астроцити за фізіологічних умов.
3.5. Ефекти розчинів BDNF за умов окисного стресу
Життєздатність клітин і продукцію ROS оцінювали в кортикальних нейронних клітинах та астроцитах, щоб зрозуміти потенційний механізм запобігання старінню 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF за умов окисного стресу. Вплив 200 мкМ H₂O₂ в обох типах клітин значно знижував (p < 0,05) життєздатність клітин порівняно з контролем (Рисунок 5A), що вказує на втрату клітин, спричинену окисним пошкодженням. Натомість після подальшого оброблення 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF життєздатність клітин зростала по-різному між типами клітин. Справді, лише в астроцитах обидва розчини BDNF значно підвищували життєздатність клітин (p < 0,05), але основний ефект спостерігався з 1 пг/мл BDNF SKA в обох типах клітин (p < 0,05 порівняно з H₂O₂ окремо), що підтверджує важливість доз і посології також за патологічних умов.
Рисунок 3. Аналіз внутрішньоклітинних шляхів, активованих розчинами BDNF в астроцитах
У лівій колонці представлено денситометричний аналіз, а в правій — приклади вестерн-блоту. Показані експресії: (a) рецептора TrkB, (b) ApoE(4), (c) SIRT1 та (d) ERK/MAPK.
Дані виражені як середнє ± SD (%) від п’яти незалежних експериментів, нормалізованих до специфічного загального білка, якщо можливо, та перевірені за допомогою детекції β-актину. * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з фізіологічним розчином; p < 0,05 порівняно з 50 нг/мл BDNF.
Рисунок 4. Аналіз рецептора TrkB в умовах блокування на астроцитах
У верхній частині представлено денситометричний аналіз, а в нижній частині — приклад вестерн-блоту. Дані виражені як середнє ± SD (%) від п’яти незалежних експериментів, нормалізованих до специфічного загального білка та перевірені за допомогою детекції β-актину. * p < 0,05 порівняно з тими ж обробками без ANA-12. ANA-12 = 1 мкг/мл.
Рисунок 5. Життєздатність клітин та продукція ROS за обома протоколами в первинних кортикальних нейронних клітинах та астроцитах в умовах окисного стресу
(a) Життєздатність клітин та (b) продукція реактивних форм кисню (ROS), виміряні в первинних кортикальних нейронних клітинах (зліва) та астроцитах (справа) після оброблення. H₂O₂ = 200 мкМ H₂O₂, доданий за 30 хвилин до стимуляції. Дані виражені як середнє ± SD (%) від п’яти незалежних експериментів, виконаних у трьох повтореннях, нормалізованих до контролю (0 лінія як контроль). * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з H₂O₂; p < 0,05 порівняно з H₂O₂ + 50 нг/мл BDNF у тих же клітинах.
Додаткові експерименти з оцінки виробництва ROS були проведені. Вплив 200 мкМ H₂O₂ на кортикальні нейронні клітини та астроцити значно підвищував внутрішньоклітинну продукцію ROS порівняно з контролем (p < 0,05), як показано на Рисунку 5B, що підтверджує наявність окисного пошкодження. Постоброблення 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF в обох типах клітин спричинило значне зниження виробництва ROS (p < 0,05) порівняно з H₂O₂ окремо, що підтверджує гіпотезу про важливість BDNF під час дегенерації для запобігання втраті клітин. Ці дані свідчать, що 1 пг/мл BDNF SKA здатний протидіяти пошкодженню, викликаному окисним стресом, з більшою ефективністю порівняно з 50 нг/мл BDNF.
Оскільки дані, отримані для двох типів клітин, були порівнянними, аналіз внутрішньоклітинних шляхів за умов окисного стресу проводився лише на астроцитах. Розчини BDNF здійснювали свої біологічні дії, покращуючи експресію рецептора TrkB навіть у присутності H₂O₂, як показано на Рисунку 6A (p < 0,05 порівняно з контролем). Значних відмінностей між двома розчинами BDNF не спостерігалося. Крім того, аналізувалася експресія ApoE та Tau, важливого білка, який модулює стабільність аксонних мікротрубочок. Як показано на Рисунку 6B, стимуляція лише H₂O₂ спричинила значне зниження експресії ApoE порівняно з контролем (p < 0,05), що вказує на втрату нейропластичності. Натомість оброблення 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF відновлювало пошкодження, і експресія ApoE зростала. Зокрема, основний ефект спостерігався при 1 пг/мл BDNF SKA порівняно з 50 нг/мл BDNF (p < 0,05, приблизно в десять разів більший). Наявність пошкодження підтверджувалася фосфорилюванням Tau, як показано на Рисунку 6C, де рівень був навіть вищим, ніж у контролі (p < 0,05). Після оброблення 1 пг/мл BDNF SKA порівняно з 50 нг/мл BDNF фосфорилювання значно знижувалося (p < 0,05, приблизно на 56%), що вказує на ефективність 1 пг/мл BDNF SKA у відновленні пошкодження. Крім того, аналіз SIRT1 підтверджує захист, який чинять 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF проти пошкодження H₂O₂ (Рисунок 6D); 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF змогли викликати значне підвищення фосфорилювання SIRT1 порівняно з H₂O₂ окремо (p < 0,05) та контролем (p < 0,05). Однак основний ефект спостерігався при 1 пг/мл BDNF SKA порівняно з 50 нг/мл BDNF (приблизно 85%). Усі ці дані підтверджують гіпотезу, що оброблення BDNF SKA може захищати нейронні клітини від пошкоджень, викликаних процесом старіння, краще, ніж BDNF у високих дозах. Нарешті, як показано на Рисунку 6E, активація TrkB викликала виживання клітин через залучення ERK/MAPK; справді, 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF, додані після пошкодження, змогли викликати значне підвищення активності ERK порівняно з H₂O₂ окремо (p < 0,05) та контролем (p < 0,05). Однак основний ефект спостерігався при 1 пг/мл BDNF SKA порівняно з 50 нг/мл BDNF (приблизно 90%).
3.6. Щоденна тривалість ефектів розчинів BDNF на нейрони та астроцити
Оскільки BDNF може використовуватися як дієтична добавка у людей, проводилися деякі експерименти для уточнення оптимального графіку дозування. Ефекти 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF протягом 24 годин вивчалися на обох типах клітин, аналізуючи концентрацію BDNF, життєздатність клітин та мітохондріальний потенціал.
Як показано на Рисунку 7A, оброблення 1 пг/мл BDNF SKA та 50 нг/мл BDNF на обох типах клітин спричинило подібне часове зростання концентрації BDNF. Цей ефект був значущим з 1 години порівняно з контролем (p < 0,05), а максимальний ефект спостерігався через 24 години (23% та 22% порівняно з контролем відповідно в нейронах; приблизно 26% та 25% порівняно з контролем відповідно в астроцитах). Значних відмінностей між двома розчинами BDNF не спостерігалося, що вказує на порівнянну ефективність низькодозового SKA з BDNF високої концентрації.
Однак 1 пг/мл BDNF мав кращу переносимість, що підтверджується кращою життєздатністю клітин (p < 0,05) порівняно з 50 нг/мл BDNF. Цей ефект був значущим, починаючи з 6 годин у нейронах та з 3 годин в астроцитах, з максимальним ефектом на обох типах клітин через 24 години (приблизно 80% та приблизно 60% порівняно з 50 нг/мл відповідно), як показано на Рисунку 7B.
Оскільки життєздатність клітин залежить від мітохондріальної активності, проводився аналіз варіації мітохондріального потенціалу (Рисунок 7C). Обидва розчини BDNF модулювали мітохондріальний потенціал залежно від часу зі значним зростанням з 3 годин у нейронах та з 30 хвилин в астроцитах порівняно з контролем (p < 0,05). Однак значних відмінностей між двома розчинами BDNF не спостерігалося.
Ці результати дозволяють стверджувати, що введення низькодозового BDNF SKA має більш сприятливі ефекти на нейрони та астроцити, ніж BDNF у високих дозах, причому ефект зберігається протягом 24 годин.
Рисунок 6. Аналіз внутрішньоклітинних шляхів, активованих розчинами BDNF в астроцитах за умов окисного стресу
Представлені дані про активність кіназ, денситометричний аналіз та вестерн-блот. Показані експресії: (a) рецептора TrkB, (b) ApoE(4), (c) Tau, (d) SIRT1 та (e) активність ERK/MAPK.
Дані виражені як середнє ± SD (%) від п’яти незалежних експериментів, а денситометричні аналізи нормалізовані до специфічного загального білка, якщо можливо, та перевірені за допомогою детекції β-актину. * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з H₂O₂; p < 0,05 порівняно з H₂O₂ + 50 нг/мл BDNF.
Рисунок 7. Ефекти розчинів BDNF протягом 24 годин на первинні кортикальні нейронні клітини та астроцити
У лівій колонці показані первинні кортикальні нейронні клітини, а в правій колонці — астроцити. (a) Кількісне визначення BDNF та (b) життєздатність клітин, виміряні після оброблення BDNF. Дані виражені як середнє ± SD (%) від п’яти незалежних експериментів, виконаних у трьох повтореннях, нормалізованих до контролю (0 лінія як контроль). (c) Мітохондріальний мембранний потенціал досліджувався за тих же умов. Дані виражені як середнє ± SD від п’яти незалежних експериментів, виконаних у трьох повтореннях, нормалізованих до контролю.
3.7. Аналіз біодоступності розчинів BDNF та їх ефектів у мозку мишей (продовження)
Для підтвердження здатності розчинів BDNF проходити через ентерогепатичний цикл і гематоенцефалічний бар’єр та діяти в тканині мозку були проведені експерименти in vivo з використанням мишей дикого типу C57BL. Оскільки у людей введення препарату було б щоденним, у деяких експериментах 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF вводили тваринам за допомогою риссолей, а концентрацію BDNF аналізували як у сироватці, так і в тканинах мозку через 24 години. Крім того, для перевірки стабільності ефектів проводилися додаткові експерименти з додаванням 24 годин без стимуляції. Як показано на Рисунку 8A, 1,2 пг/мл BDNF SKA мав більшу здатність проходити через ентерогепатичний цикл порівняно з 25 нг/мл BDNF. Важливо також перевірити його присутність у тканині мозку (Рисунок 8B). При введенні як 1,2 пг/мл BDNF SKA, так і 25 нг/мл BDNF вони змогли проникати в мозок, як показано в аналізі кількісного визначення BDNF (p < 0,05 порівняно з контролем). Крім того, 1,2 пг/мл BDNF SKA залишався в тканині мозку довше (24 години плюс 24 години) порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно 55%, p < 0,05) та 1,2 пг/мл BDNF SKA через 24 години (приблизно 20%, p < 0,05). Ці результати демонструють важливість дозування та посології введення BDNF SKA для забезпечення кращого впливу на тканину мозку.
Рисунок 8. Кількісне визначення BDNF у мишей у сироватці та тканині мозку
- Кількісне визначення в сироватці та (b) кількісне визначення BDNF у тканині мозку. Кожен графік містить зліва результати, отримані через 24 години (12 тварин), а справа (12 тварин) — через 24 години плюс 24 години (24 год + 24 год). Дані виражені як середнє ± SD (%) нормалізоване до контролю (0 лінія як контроль). * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з фізіологічним розчином; p < 0,05 порівняно з тими ж обробками в той же час введення; p < 0,05 порівняно з тими ж обробками через 24 години та 24 години плюс 24 години.
Для перевірки, чи механізм, активований розчинами BDNF, є таким самим, як той, що спостерігався в клітинах під час експериментів in vitro, досліджувалися ефекти 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF на деякі основні маркери за допомогою вестерн-блоту. Оскільки BDNF необхідний для виживання нейронів у мозку, після кодування цим геном досліджувалася його експресія, як показано на Рисунку 9A. Як 1,2 пг/мл BDNF SKA, так і 25 нг/мл BDNF через 24 години та 24 години плюс 24 години змогли викликати експресію BDNF порівняно з контролем (p < 0,05), що вказує на кращий вплив стимуляцій. Крім того, 1,2 пг/мл BDNF SKA через 24 години та 24 години плюс 24 години спричинив значне зростання порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно 50% та приблизно 62% відповідно), що вказує на індукцію ендогенного виробництва BDNF за допомогою фізіологічного механізму, як показано значним зростанням, викликаним 1,2 пг/мл BDNF SKA через 24 години плюс 24 години порівняно з 24 годинами (p < 0,05, приблизно 24%).
Рисунок 9. Вестерн-блот та денситометричний аналіз білка BDNF (a), рецептора TrkB (b) та білка APP (c) у тканині мозку У лівій колонці представлено денситометричний аналіз, а в правій — приклади вестерн-блоту. Кожен графік містить зліва результати, отримані через 24 години (12 тварин), а справа — через 24 години плюс 24 години (24 год + 24 год) (12 тварин). Дані виражені як середнє ± SD (%) від незалежних експериментів, нормалізованих до специфічного загального білка, якщо можливо, та перевірені за допомогою детекції β-актину. * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з 25 нг/мл BDNF у той же час введення; p < 0,05 порівняно з 1,2 пг/мл BDNF SKA між 24 годинами та 24 годинами плюс 24 години; p < 0,05 порівняно з 25 нг/мл BDNF між 24 годинами та 24 годинами плюс 24 години.
Ці ефекти опосередковувалися рецептором TrkB, який експресувався подібним чином у обидва часові періоди оброблення для 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF (p < 0,05 порівняно з контролем, Рисунок 9B). Оскільки попередник β-амілоїду (APP) відіграє центральну роль, сприятливі ефекти обох розчинів BDNF також оцінювалися шляхом кількісного визначення APP, як показано на Рисунку 9C. 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF підвищували APP порівняно з контролем (p < 0,05) через 24 години, причому 1,2 пг/мл BDNF SKA мав більший ефект порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно в 2,5 рази). Крім того, активність APP через 24 години плюс 24 години продемонструвала фізіологічну дію 1,2 пг/мл BDNF SKA порівняно з 25 нг/мл BDNF (p < 0,05), що вказує на кращу регуляцію, здійснювану 1,2 пг/мл BDNF SKA на тканину центральної нервової системи.
Оскільки дослідження in vivo та in vitro свідчать, що ApoE може сприяти нейродегенерації через залежний від Аβ механізм, також оцінювалася експресія ApoE. Як показано на Рисунку 10A, спостерігалося значне зростання експресії ApoE порівняно з контролем (p < 0,05) у присутності як 1,2 пг/мл BDNF SKA, так і 25 нг/мл BDNF у обидва часові періоди, що вказує на позитивний ефект BDNF на тканину центральної нервової системи. Крім того, активація TrkB за допомогою 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF змогла викликати значне підвищення експресії ERK порівняно з контролем (p < 0,05) у обидва часові періоди. Таким чином, можна припустити потенційну роль BDNF у відновленні тканини через залучення ERK/MAPK (Рисунок 10B). Ці результати підтверджують спостереження в астроцитах. Однак основний ефект спостерігався через 24 години у присутності 1,2 пг/мл BDNF SKA порівняно з 25 нг/мл BDNF (p < 0,05, приблизно в три рази вище) та 1,2 пг/мл BDNF SKA через 24 години плюс 24 години (p < 0,05, приблизно 30%). Останній тест цієї серії експериментів стосувався вивчення експресії SIRT1. Аналіз SIRT1 підтверджує сприятливі ефекти, викликані 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF (Рисунок 10C). У обидва періоди (24 години та 24 години плюс 24 години) 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF змогли викликати значне підвищення фосфорилювання SIRT1 порівняно з контролем (p < 0,05). Однак основний ефект спостерігався для 1,2 пг/мл BDNF SKA у обидва часові періоди порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно 70% та 73% відповідно, p < 0,05). Усі ці результати підтверджують гіпотезу, що оброблення BDNF SKA може викликати фізіологічні механізми, потенційно здатні сповільнити дегенерацію та захистити мозок з часом.
3.8. Ефекти розчинів BDNF у мозку мишей з плином часу
Для перевірки, чи ефективність BDNF SKA зберігається протягом тривалого часу, мишей обробляли за 6-денним протоколом, який раніше використовувався в клітинних експериментах. Як показано на Рисунку 11A, введення 1,2 пг/мл BDNF SKA та 25 нг/мл BDNF підтримувало рівні BDNF у сироватці до шести днів порівняно з контролем (p < 0,05). Крім того, 1,2 пг/мл BDNF SKA зміг підтримувати високий рівень BDNF порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно вдвічі вище). Аналогічно, введення 1,2 пг/мл BDNF SKA продемонструвало кращу ефективність (p < 0,05) порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно 80%) на рівні тканини мозку (Рисунок 11B). Ці дані свідчать, що BDNF SKA має тенденцію залишатися присутнім у тканині мозку протягом тривалого часу навіть за відсутності оброблення, викликаючи його фізіологічне вироблення краще, ніж BDNF у високих дозах.
Для підтвердження цього проводилися додаткові експерименти для аналізу білка BDNF (Рисунок 11C) та рецептора TrkB за допомогою вестерн-блоту (Рисунок 11D). Обидва білки показали значне зростання через шість днів після введення обох розчинів BDNF, але 1,2 пг/мл BDNF SKA спричинив значне підвищення порівняно з 25 нг/мл BDNF (приблизно вдвічі вище для кожного, відповідно, p < 0,05). Ці результати підтверджують гіпотезу про тонку ендогенну регуляцію, яку здійснює BDNF SKA на підтримку та функцію мозку.
Рисунок 10. Вестерн-блот та денситометричний аналіз експресії ApoE (a), ERK/MAPK (b) та SIRT1 (c) у тканині мозку У лівій колонці представлено денситометричний аналіз, а в правій — приклади вестерн-блоту. Кожен графік містить зліва результати, отримані через 24 години (12 тварин), а справа — через 24 години плюс 24 години (24 год + 24 год) (12 тварин). Дані виражені як середнє ± SD (%) від незалежних експериментів, нормалізованих до специфічного загального білка, якщо можливо, та перевірені за допомогою детекції β-актину. * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з 25 нг/мл BDNF у той же час введення; p < 0,05 порівняно з 1,2 пг/мл BDNF SKA між 24 годинами та 24 годинами плюс 24 години.
Рисунок 11. Кількісне визначення BDNF та внутрішньоклітинні шляхи в мозку (a) Кількісне визначення BDNF у сироватці та (b) у тканині мозку мишей. Дані виражені як середнє ± SD (%) від n = 7 незалежних експериментів, нормалізованих до контрольного значення (0 лінія). * p < 0,05 порівняно з контролем; ** p < 0,05 порівняно з фізіологічним розчином; p < 0,05 порівняно з 25 нг/мл BDNF. (c) Експресія BDNF та (d) рецептора TrkB у мозку мишей представлені як денситометричний аналіз (зліва) та приклади вестерн-блоту (справа). Дані виражені як середнє ± SD (%) від n = 7 незалежних експериментів, нормалізованих до специфічного загального білка, якщо можливо, та перевірені за допомогою детекції β-актину.
Обговорення
Сьогодні нейродегенеративні розлади вважаються хронічними та невиліковними станами, чиї обмежуючі ефекти можуть тривати роками або десятиліттями. Це становить величезний тягар страждань для пацієнтів і значні витрати для організацій охорони здоров’я. Оптимальні когнітивні функції пов’язані з ефективною нейронною пластичністю та здатністю нейронів або гліальних клітин покращувати ефективність синапсів через біохімічні та морфологічні зміни як на дендритному, так і на аксонному рівнях [44]. Однак, як повідомляється у багатьох дослідженнях, ця здатність значно знижується з віком [15]. Наразі доступні методи лікування цих хвороб здебільшого є симптоматичними або паліативними і включають модулятори нейротрансмітерів, гормональну терапію, протизапальні препарати, глибоку стимуляцію мозку та рослинні продукти. Таким чином, існує нагальна потреба в розробці нових рішень, здатних відновити фізіологічні функції тканини мозку. Крім того, однією з основних проблем, що стосуються введення активних інгредієнтів у центральну нервову систему, є подолання гематоенцефалічного бар’єру. Сучасні системи доставки ліків можуть складатися як з біорозкладних, так і з не біорозкладних форм, які пропонують переваги у захисті, абсорбції, проникненні та розподілі активних інгредієнтів. З цієї причини використання молекул, уже відомих своїми унікальними функціями в мозку і, відповідно, фізіологічно схильних легко перетинати гематоенцефалічний бар’єр, можна вважати слушним варіантом.
Останнім часом увага дослідників зосередилася на ролі нейротрофічних факторів у розвитку нейронного занепаду. Наразі відомо, що існує три основні нейротрофічні фактори: нейротрофічний фактор мозку (BDNF), фактор росту нервів та нейротрофічний фактор, отриманий з гліальних клітин [45]. Зокрема, BDNF асоціюється з модуляцією нейропластичності, що сприяє здоров’ю нервової тканини, а також має здатність протидіяти ефектам прозапальних цитокінів, які є ключовими факторами в нейродегенеративних процесах [46]. В останні роки гіпотезувалась можливість використання терапії факторами росту, спираючись на зростаючу інформацію, накопичену дослідженнями, головним чином щодо BDNF. Справді, BDNF, здається, має реальний терапевтичний потенціал, заснований на спостереженні, що в багатьох розладах нервової системи рівні BDNF у сироватці змінюються [47]. Однак основною проблемою є доставка молекули до уражених клітин. Хоча численні дослідження досліджували можливість введення BDNF через різні підходи, такі як вектори генної терапії, розробка міметичних пептидів або навіть пряме введення в нервову систему, результати все ще обмежені через брак простоти використання [47]. Спроби перорального введення BDNF досі давали слабкі результати через те, що BDNF є білком середнього розміру та зарядженою молекулою, і його транспорт через кишковий бар’єр та ГЕБ не є чітко визначеним [47].
Ключовою ідеєю цієї роботи є використання низькодозового розчину BDNF для уникнення можливих побічних ефектів сучасних терапій (таких як сенсибілізація та алергічні реакції), підкріплюючи експериментальними даними новий потенційний терапевтичний підхід для лікування або профілактики нейродегенеративних захворювань. Концепція низьких доз є важливим і новаторським аспектом і показала свою ефективність у багатьох дослідженнях. Наприклад, експерименти з оброблення низькими дозами інтерферону проводилися на багатьох видах тварин [48]. Ця терапія продемонструвала значне клінічне покращення в моделях як інфекційних, так і хронічних запальних захворювань [49].
Ця робота продемонструвала в експериментальних моделях in vitro, що BDNF здатний перетинати як кишковий бар’єр, так і ГЕБ, підтверджуючи безпеку його використання. Дослідження також вперше демонструє ефективність низькодозового BDNF SKA у протидії окисному пошкодженню, яке є одним із механізмів, що лежать в основі вікової нейродегенерації. Можливість введення BDNF у дуже малих кількостях є великою перевагою як з точки зору низького ризику побічних ефектів, так і з точки зору нижчої вартості лікування.
У дизайні дослідження було вирішено використати особливу техніку приготування розчину, яка називається SKA. Гіпотезується, що механізм дії біоактивних молекул, таких як гормони, нейропептиди та фактори росту, підданих SKA та введених у низьких дозах, полягає в сенсибілізації або активації деяких клітинних (або плазмових) рецепторних одиниць завдяки їх високому розведенню, що фактично відповідає їх фізіологічній дії на рівні мікрогам для гормонів [50] та пікограм для інших молекул-месенджерів [51]. Метод SKA використовувався в попередніх роботах, які показали, що розчини SKA мають кращі біологічні ефекти, ніж відповідні розчини, які не піддавалися такій обробці [20,21,29]. У цьому дослідженні показано, що BDNF SKA не викликає нейронного стресу і здатний протидіяти утворенню ROS.
Під час старіння мозку першими ознаки дегенерації виявляють астроцити, хоча згодом найважливішим місцем пошкодження є кортикальні нейрони [52]. BDNF SKA здатний підвищувати життєздатність клітин як у нейронних клітинах, так і в астроцитах, що є важливим ресурсом для здоров’я нервової системи.
Крім того, метою цього дослідження було дослідити часові характеристики введення, щоб визначити, чи можливо встановити ефективний протокол, який можна було б використовувати для людей у майбутньому. Можна припустити, що шестиденний протокол, який складається з одноразового введення з подальшими вимірюваннями протягом шести днів, стимулює клітини без перевантаження нормальної фізіологічної регуляції. Таким чином досягається більше проникнення BDNF через ГЕБ, а також індукується низька концентрація ROS і знижений нейронний стрес. У такий спосіб активуються нормальні фізіологічні процеси клітин. Частина дослідження in vivo дозволила продемонструвати, що BDNF SKA має високу здатність проходити через ентерогепатичний цикл і залишатися в кровотоці щонайменше 24 години. Це робить BDNF SKA потенційним кандидатом для використання як дієтична добавка. Оскільки BDNF, необхідний для виживання нейронів, синтезується після кодування його специфічним геном, у цьому дослідженні вивчалася його експресія. Ми спостерігали, що BDNF SKA через 24 години плюс 24 години зміг викликати експресію ендогенного BDNF, що вказує на кращий ефект стимуляції та індукції виробництва ендогенного BDNF. Сприятливі ефекти BDNF SKA також підтверджувалися аналізом попередника амілоїдного білка. У сукупності наші результати свідчать, що одночасна активація принаймні ERK/MAPK необхідна для опосередкування повної BDNF-залежної активації промотора APP [53].
Білок-попередник амілоїду (APP) відіграє центральну роль у розвитку хвороби Альцгеймера; було показано, що його експресія, метаболізм, сплайсинг і секреція регулюються лігандами мембранних рецепторів тирозинкіназ, таких як BDNF [54]. Крім того, дослідження внутрішньоклітинних шляхів продемонструвало значне підвищення експресії ApoE, який є членом родини генів рецепторів ліпопротеїнів низької щільності, що переважно продукується астроцитами в мозку. ApoE був ідентифікований як рецептор, який опосередковує поглинання та кліренс амілоїду (Aβ) астроцитами, тим самим підвищуючи рівні гліальних LDLR, що може сприяти деградації Aβ у мозку [55–57]; ці дані вказують на позитивний ефект на трофіку мозку, який чинить BDNF SKA, та на підвищення фосфорилювання SIRT1, що підтверджує потенційну роль у протидії відомим механізмам, які призводять до старіння мозку. Справді, нещодавно було показано, що SIRT1 відіграє роль у нормальній когнітивній функції та синаптичній пластичності, протидіючи когнітивному зниженню та нейродегенеративним захворюванням при старінні [58,59].
Ефективність BDNF SKA була ретельно досліджена, що дозволило підтримувати рівні BDNF у сироватці до шести днів після одноразового введення; ці дані свідчать, що BDNF SKA здатний залишатися в нервовій тканині протягом тривалого часу навіть за відсутності оброблення, викликаючи його власне фізіологічне вироблення клітинами краще, ніж BDNF у високих дозах. Усі наші результати підтверджують гіпотезу, що оброблення BDNF SKA може захищати мозок з часом, викликаючи фізіологічний механізм, здатний сповільнити дегенерацію клітин, і може бути можливою терапевтичною стратегією для літнього населення з метою покращення когнітивних функцій. BDNF також здатний чинити ефекти поза нервовою системою, наприклад, на імунну систему [60]. Тому можна припустити взаємодію між імунною системою та ефектами, описаними в цій роботі. Відсутність цього аспекту може бути слабким місцем нашого дослідження, яке буде доповнене в подальших дослідженнях. З іншого боку, однією з сильних сторін цього дослідження є підтвердження ефективності та безпеки низькодозового BDNF. Введення низьких доз зменшує побічні ефекти активних молекул, не знижуючи їх ефективності, що є важливим і новаторським аспектом. Справді, клінічна практика давно зрозуміла важливість малих стимулів порівняно з сильними, які запускають механізми саморегуляції та самовідновлення в організмі [61].
Під час старіння мозку спостерігається зниження нормальних антиоксидантних захисних механізмів, що призводить до підвищеної вразливості мозку та, зрештою, до шкідливих ефектів окисного пошкодження [8]. Дійсно, великий обсяг експериментальних досліджень вказує, що мозок дуже сприйнятливий до окисного пошкодження через високу концентрацію поліненасичених жирних кислот і перехідних металів, які беруть участь у генерації гідроксильного радикала [62,63]. Члени родини ROS, якщо їх належним чином не детоксикувати, запускають процес окисного пошкодження, який можна визначити як ланцюгову реакцію, що призводить до послідовного пошкодження всіх клітинних компонентів, зокрема ліпідів і білків [64]. Окисний стрес вважається одним із основних механізмів клітинного старіння через легкість посилення пошкодження та велику кількість цільових молекул [8]. Когнітивні дефіцити є найпоширенішими наслідками процесу старіння і характеризуються масовою втратою нейронів, когнітивною дисфункцією та втратою пам’яті. Їх частота та поширеність постійно зростають із віком [65]. Дійсно, було показано, що низькі рівні BDNF у сироватці пов’язані з підвищеним когнітивним порушенням [66]. Крім того, BDNF допомагає захищати нейрони від пошкоджень, викликаних інфекцією або травмою [45], і бере участь у рості та підтримці нейронів, а також у різних аспектах активності-залежної синаптичної фізіології, діючи в різних просторових і часових доменах [67]. Однак через труднощі, пов’язані з введенням екзогенних білків у центральну нервову систему (ЦНС), важливо розглянути можливість використання ендогенних джерел BDNF, наприклад, шляхом індукції підвищеної активності гліальних клітин. Добре відомо, що гліальні клітини підвищують експресію різноманітних факторів росту, включаючи BDNF. Зокрема, у мозку дорослих астроцити відповідають за підтримку нейронної та синаптичної функції [68].
Висновки
На завершення, це дослідження демонструє чіткі ознаки ефективності BDNF у клітинних моделях. Звичайно, наступним кроком буде проведення дослідження щодо поведінкових ефектів. Якщо на цьому другому етапі також будуть підтверджені сприятливі ефекти, можна припустити, що BDNF у майбутньому може бути корисним агентом для модуляції пошкодженого мозкового середовища для покращення відновлення під час демієлінізуючих захворювань і, можливо, інших дегенеративних станів.
Рисунок A1. Приготування риссолей Риссолі готувалися в стерильному середовищі шляхом подрібнення корму (Global Diet, Envigo plus) (A). Порошок (4,5 г) змішували з 2,5 мл стерильної води (B) та 450 мкл розчинів BDNF (C). Корм готували та замішували під витяжкою (D) для формування риссолі, яку загортали в фольгу, стерилізовану теплом (E). Незабаром після цього риссоль висушували під витяжкою для збереження стерильності протягом 18–24 годин. Наприкінці риссоль (F) розміщували в клітці з мишею, яка швидко її з’їдала.
Рисунок A2. Продукція ROS на кишковому бар’єрі
Дані виражені як середнє ± SD (%) від п’яти незалежних експериментів, виконаних у трьох повтореннях (0 лінія як контроль). Saline = фізіологічний розчин. * p < 0,05 порівняно з контролем, ** p < 0,05 порівняно з 50 нг/мл BDNF.